博凯森现提供基于 10X Genomics Chromium 系统的多种单细胞分析解决方案，可用于稀有或异质细胞群的分析。
10x 测序简介
单细胞可以更轻松地分析稀有或异质细胞群体。传统“整体”测序方法(bulk)的平均化处理不能直接评估生物学的基本单位——细胞（或基因组的单个细胞核）。博凯森利用 10x Genomics 系统及其工程化试剂传递方法，提供单细胞水平的基因组与遗传分析。 基于液滴的 Chromium 10x 系统平台由 GemCode 技术驱动，为生物医学研究人员和临床医生提供强大工具。 同时，”油包水“液滴平台提升了细胞通量并将反应缩小至纳米级，显著提高了检测灵敏度与定量准确性。该方法可直接分析稀有细胞类型或样本不足以进行常规批量测序的原代细胞。 它还适用于从复杂群体中解析亚群，例如肿瘤组织中的恶性肿瘤细胞或免疫群体中的高响应细胞，甚至有可能发现全新细胞类型。 10X Genomics 同样支持对胚胎发育、癌症、肌母细胞与肺上皮分化、淋巴细胞命运分化等过程中的细胞状态进行研究。
在数分钟内将样本封装至数百至数万个具有唯一标识序列的微反应体系中，每个体系含有用于下游分析的细胞条形码（barcode）。 含有数百万条形码的寡肽苷酸的凝胶珠与样本（可为高分子量 DNA、单个细胞、细胞核或 Cell Beads）混合后加入油-表面活性剂溶液中形成 GEMs（凝胶珠乳液），GEMs 作为独立反应体系进行条形码标(barcode)。 条形码产物随后用于下游反应，生成兼容短读长测序仪的文库。测序后，通过条形码信息将读段映射回其原始分子、单个细胞或细胞核。
10x Chromium 基因组文库片段的示意图
Chromium™ 单细胞基因表达解决方案
提高细胞通量是从复杂组织中识别细胞类型的关键。10X Genomics Chromium 单细胞基因表达解决方案可用于在单个细胞中进行转录组测量，测序大量单细胞可再现整体转录组的复杂性。 博凯森致力于提供高质量单细胞转录组分析服务，结合该解决方案与配套软件工具，可从单细胞构建高复杂性文库，最大程度获取样本信息。 Cell Ranger 分析流程进行初步分析与可视化，包括去混合、比对与基因计数等标准分析步骤。该流程利用 10x 条形码生成具有单细胞分辨率的表达数据，支持细胞聚类、类型分类与差异表达分析等应用，适用于数百至数万个细胞。
Chromium™ 系统通过将细胞分配至纳升级 GEM 中进行转录组分析，通常分析 1000-6000 个细胞。每个 GEM 内 cDNA 共用一个 10x 条形码，可将读段溯源至原始细胞。GEM 孵育后生成带条形码的全长 cDNA，3' 端单细胞文库使用标准 Illumina 双端建库结构，以 P5 与 P7 开始和结束。10x 条形码（16 bp）与 UMI（12 bp）编码在 Read 1 中的前几个碱基对，样本索引则为 i7 Index Read。
The Chromium™ cell partitioning workflow for scRNA sequencing
10x Genomics 单细胞测序方案需使用可存活的单细胞或单核悬液作为输入样本。研究人员需提交经充分解离的活细胞悬液。为了获得高质量数据，至关重要的是最大程度地保持细胞活性，同时尽可能减少细胞核聚集、死亡细胞、细胞碎片、胞质核酸以及反转录潜在抑制剂的存在。准确的细胞计数对于实验成功至关重要。推荐的单细胞悬液浓度为700–1200 个细胞/μl，以实现最佳目标细胞回收率。建议对细胞悬液进行3–4次计数，且所有计数之间的标准差应小于< 25%.
- Feature barcoding: 细胞表面条码标记
Feature Barcoding技术可用于细胞表面蛋白条码标记，从而实现样本复用（Multiplexing）和双细胞识别（Doublet Detection），同时有助于识别细胞表面蛋白亚型、检测低丰度转录本对应蛋白表达、增强表型精度识别能力。
- Feature barcoding: CRISPR筛选
通过集成CRISPR筛选功能，可在单次实验中，对成百上千至数万个单细胞进行高通量、可扩展的功能遗传筛选分析。
Chromium™ 单细胞免疫组库解决方案
Chromium 单细胞免疫组库方案是一套系统化解决方案，用于在单细胞水平深入解析数百至数万个T/B细胞的人类或小鼠适应性免疫系统。博凯森提供简洁高效的工作流程，从细胞悬液、文库构建、免疫测序到软件分析一体化完成，实现全长V(D)J片段的组装与注释，同时可在同一细胞中同步检测TCR、Ig以及5’端基因表达。 单细胞悬液加载至系统后被包裹进GEMs（油包水微液滴）中，每个GEM内的转录本都被赋予特异性细胞条形码。条码化的cDNA随后被合并用于后续处理与建库。用于免疫库的cDNA会进行T/B细胞受体靶向富集，再进行文库构建，最终形成可用于Illumina测序的Chromium 单细胞V(D)J文库。
在V(D)J富集文库中，Read 1读取内容包括：16 bp的10x条形码、10 bp的UMI、13 bp的Switch Oligo及富集转录本5’端序列；在5’端基因表达文库中，Read 1包含16 bp 10x条形码与10 bp UMI。由于酶切片段化的缘故，两类文库的Read 2均为转录本的随机内部片段。样本标签序列则作为i7 index读取。如下图所示：.
Chromium 单细胞 V(D)J 富集文库结构
5'端基因表达文库结构
The Chromium™ Linked-Reads 测序方案
Chromium 基因组Linked-Reads测序解决方案可通过分子条码将来自同一长DNA片段的短读段进行标记，从而补充传统方法中缺失的长距离信息。系统将每一个长DNA片段生成的所有短读段统一赋予一个唯一条码，使得后续可以将这些短读段重新拼接为原始的DNA片段。该方案适用于克服NGS盲区、识别结构变异、分辨单倍型以及进行高质量 de novo 基因组组装。
The Chromium™ 单细胞拷贝数变异分析方案
博凯森可提供基于单细胞DNA的建库测序及CNV变异分析服务，实现单细胞水平的基因组CNV检测。
在全基因组测序中，以高分子量（HMW）基因组DNA为起始材料，构建包含独特条码的文库；若进行全外显子分析，则可加入Agilent SureSelectXT Human All Exon V6试剂盒进行靶向富集，获得最佳的外显子区数据。最优性能表现通常要求输入gDNA的平均长度大于65 kb，本方案同时提供高质量HMW gDNA提取方法。
The Chromium™ 单细胞 ATAC 测序方案
10x Chromium™ 系统设计的单细胞ATAC（Assay for Transposase Accessible Chromatin）方案，助力科研人员从成千上万个细胞中深入解析基因组的调控结构与表观遗传变异。此方案可对每个细胞的开放染色质区域进行特异性标签，并通过转座酶将适配器接入活跃区域。每个核的转座DNA片段均被赋予约75万个可能的10x条码之一，可实现500–10,000个细胞/通道的开放染色质图谱绘制。
交付内容
- 原始测序数据
- 实验结果数据
- 数据分析报告
- 个性化分析方法method
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