纳米孔直接RNA测序

纳米孔直接RNA测序介绍

目前，互补DNA（cDNA）的高通量测序（NGS RNA-seq）使RNA生物学的转录组研究成为可能。这些RNA-seq方法检测合成反应的产物，而不是直接检测RNA分子。新的第三代测序正在开发中，以克服扩增偏差、缺乏单分子敏感性和异构体模糊性等局限性。这提高了RNA分析的易用性和速度，同时产生了更丰富的生物信息。此外，NGS RNA-seq并不特别适合分析短、降解和/或少量的RNA样本。

在这里，我们博凯森生物提供纳米孔直接单分子RNA测序，这是一种高度平行、实时、单分子的方法，无需事先将RNA转化为cDNA。这种方法产生全长、链特异性的RNA序列，能够直接检测RNA中的核苷酸类似物，并为高通量和低成本的直接RNA测序提供了一条途径，实现了对转录组进行全面和无偏见理解的最终目标。

牛津纳米孔技术公司的基于纳米孔的平台在DNA、RNA、蛋白质和小分子穿过纳米孔时检测它们，而不需要酶合成反应。该平台由嵌入单个流动池上数千个单独合成聚合物膜阵列中的单个纳米孔组成。电势驱使DNA朝向纳米孔并进入纳米孔。当单个DNA分子被捕获在孔中，并被工程化的运动蛋白以一致的速率穿过孔时，它会对纳米孔电流产生扰动，循环神经网络（RNN）将其转化为碱基序列。该技术提供长测序读取（高达2Mb）和表观遗传标记检测。

主要特征和优势

• 低输入量与快速、简化的工作流程相结合，实现了高度灵敏的基因表达分析。
• 全长转录本纳米孔测序提供的长全长读取的高产量允许明确鉴定剪接变体和基因融合
• 准确的转录和异构体定量
• 使用直接RNA测序消除PCR偏倚
• 使用直接RNA检测核苷酸序列旁边的碱基修饰
• 易于识别反义转录本

项目工作流程

使用纳米孔测序平台进行直接RNA测序，使用500-700ng的聚（A）RNA（以确保有足够的材料用于测序）作为文库制备的输入。使用T4 DNA连接酶将RNA连接到聚（T）接头。连接接头后，用RNAClean珠纯化产物。然后使用T4 DNA连接酶将预装有运动蛋白的测序接头连接到前一个接头的悬垂部分，并再次清理最终的文库。使用Qubit荧光计对RNA文库进行定量。将最终的RNA文库添加到流动池中，并在纳米孔测序平台上进行。

服务规范

	样品要求 Total RNA ≥ 1µg, Tissue: 500mg-1g; Cell ≥108. RIN>8, 28S/18S≥1.5 OD260/280~2.0，OD260/230:2.0-2.2 所有RNA样本的纯度和数量都经过验证
	测序服务策略 ONT平台，库：8K， 2G/每个样本
	应用 基因功能：关注具有特定功能的样本，揭示不同功能的主要原因 基因结构：选择性剪接、APA、融合基因、SSR、CDS预测、TSS/TES鉴定等。 全长转录物定量：找到全面有效的差异转录本并鉴定功能基因 RNA甲基化：直接全长转录组测序可以在RNA水平检测碱基修饰，如m6A/m5C

参考文献:
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[3] Feng，Jiang，Jie，et al.通过5'-Cap捕获的长读直接RNA测序揭示了Piwi对蝗虫转座因子广泛外显的影响。J RNA生物学, 2019.
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