博凯森的 GenSeqTM 专有技术提供全面的单细胞测序服务。这些来自单个细胞的全球基因表达模式已经极大地推动了细胞生物学的发展。
单细胞测序简介
单细胞测序是一种用于扩增和测定单个细胞中 DNA/RNA 的新兴技术。其原理是利用 MDA 或 MALBAC 技术高效扩增分离出的单细胞 DNA/RNA，随后进行深度测序。结合强大的生物信息学分析，我们能够获取细胞异质性、细胞群体差异及细胞进化等信息。单细胞基因组学有助于揭示细胞谱系关系； 单细胞转录组学将取代粗略的标志物定义方式；而单细胞表观基因组学和蛋白质组学则使我们能够分析单个细胞的功能状态。 博凯森致力于提供高质量的单细胞 RNA 测序、单细胞 DNA 测序、单细胞 DNA 甲基化测序和10X Genomics 单细胞测序服务。
应用领域：
- 稀有临床样本的表达谱研究
- 评估肿瘤内异质性并指导化疗方案
- 肿瘤进展过程中癌细胞进化分析
- 胚胎植入前遗传诊断（PGD）
博凯森的单细胞试剂盒可扩增出适用于寡核苷酸芯片分析（aCGH）或 qPCR 的 DNA 片段，并支持 CNV、SNP 分型、突变检测与测序分析。
单细胞测序优势
- 完整流程：实现对单个细胞全转录组的端到端分析。
- 超高通量：每轮可并行处理多达 96 个单细胞样本。
- 操作简便：总操作时间不足三小时，无需 RNA 片段化和纯化步骤，直接从单细胞起始。
- 性价比高：成本仅为其他建库系统的八分之一。
单细胞测序工作流程
随着流式细胞术和激光捕获显微切割等技术的发展，使得捕获单个细胞成为可能。随后可对单个细胞中的 DNA 或 RNA 进行扩增和测序。下图为单细胞测序的一般流程。
服务规格
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样本要求与准备
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测序平台
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生物信息学分析
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交付内容
- 原始测序数据
- 实验结果报告
- 数据分析报告
- 适用于论文撰写的定制化内容说明
博凯森的单细胞测序服务聚焦于细胞在组织与器官功能中的变异关系，进一步揭示疾病的发生机制。如您有任何额外需求或疑问，欢迎随时联系我们。
1. 单细胞基因组扩增的原理、优缺点
i. MDA（多位移扩增，Multiple Displacement Amplification）
MDA 由 Laskin 等人于 2001 年开发。该方法使用随机六聚体引物和 φ29 DNA 聚合酶进行反应，具有较强的链置换能力，在等温条件下可扩增 50~100kb 的 DNA 片段。同时，由于 φ29 DNA 聚合酶具有 3'-5' 外切酶活性和校对功能，因而扩增的保真度较高。MDA 方法具有更高的基因组覆盖度。
ii. MALBAC（多重退火和环化扩增循环，Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles）
MALBAC 采用准线性扩增方式，降低了指数扩增的序列偏好性。扩增引物的 5' 端为 27bp 的公共序列，3' 端为 8bp 的随机序列，可在 15~20°C 的低温下与模板结合，经过 8~12 个准线性循环后，再扩增这些环状产物。
MALBAC 方法的优点是不同细胞之间的序列偏好具有可重复性，扩增均一性更好，因此更适用于 CNV 分析。但其缺点在于所使用的聚合酶保真性不及 φ29 DNA 聚合酶，因此在检测 SNV 时容易出现假阳性；此外，因其重复性序列偏好，有时会在扩增过程中丢失基因组中扩增效率较低的区域。
2. 单细胞测序的样本要求
MDA 扩增：样本体积不得超过 2 μL，建议使用公司提供的 PCR 管，内含 2 μL PBS。
MALBAC 扩增：样本体积不得超过 1 μL，需确保样本中无 Ca2+ 和 Mg2+，公司提供的反应管中含有 4 μL 裂解液。
建议样本尽量单独分离，避免细胞聚集或碎片，以确保扩增质量。
膜性肾病患者外周血单个核细胞中组蛋白H3K9三甲基化的ChIP-seq分析
Journal: Brazilian Journal of Medical and Biological Research
Published: 12 December 2013
研究背景
膜性肾病（MN）是一种以肾小球基底膜弥漫性增厚及上皮下免疫复合物沉积为特征的疾病，是成人特发性肾病综合征最常见的病因，发病率为每年每百万人 5-10 例。已有多项研究证实多个实验机制与 MN 的发病过程密切相关，但 MN 的特异性生物标志物尚未被完全阐明。
研究结果
本研究中，作者利用染色质免疫共沉淀结合高通量测序技术（ChIP-seq）分析了 10 例 MN 患者与 10 名健康对照者的外周血单个核细胞中甲基化组蛋白 H3K9me3 的变化。研究共发现 108 个基因在 MN 患者中与对照组相比存在显著表达差异，其中 75 个基因显示 H3K9me3 活性增强，33 个基因活性下降。最终选取了 5 个差异显著的阳性基因进行定量验证，分别为：DiGeorge 综合征关键区域基因 6（DGCR6）、分选连接蛋白 16（SNX16）、接触素 4（CNTN4）、抑凋亡蛋白重复序列 3（BIRC3）和 2（BIRC2）。结果显示 MN 患者存在显著的 H3K9me3 改变。
表格1：ChIP-seq 比对结果统计
Aligned reads：与参考基因组比对上的读段数；Aligned reads only：只比对上的读段数；% Aligned：比对读段占总数比例；% Only：只比对读段占总数比例。
图1：MN 患者中 H3K9me3 的 ChIP-seq peak 分布（距离）
图2：全基因组范围内的 peak 分布与注释基因的关系
图3：基于 Gene Ontology（GO）分析的 peak 所在基因分布（AmiGO 1.8）。横轴为 GO 术语，左纵轴为相关基因的比例，右纵轴为相关基因的数量。
表格2：MN 患者中 H3K9me3 motif 的基本信息
S：C+G；R：A+G；K：T+G；Y：C+T；M：A+C；V：A+C+G。
图4：ChIP-seq motif 图标。横轴表示 motif 所在位点，纵轴总高度表示 motif 的保守性，单个碱基高度代表其在该位点的概率。
表格3：MN 患者与健康对照之间存在 H3K9me3 改变的部分基因（ChIP-seq 鉴定）
综上所述，作者认为这些结果有望为阐明 MN 的发病机制提供线索。H3K9me3 的新发现表明其可能成为一种潜在的 MN 表观遗传治疗靶点或生物标志物。
参考文献
Sui W G, et al. ChIP-seq analysis of histone H3K9 trimethylation inperipheral blood mononuclear cells of membranous nephropathy patients. Brazilian journal of medical and biological research , 2014, 47(1):42-9.
