什么是纳米孔测序
牛津纳米孔技术公司开发了基于纳米孔的DNA和 RNA测序 技术。Nanopore测序仪已被证明与多种输入材料兼容，如基因组DNA、扩增DNA、cDNA和RNA。用于生物分子测序的Nanopore技术在生命科学中具有广泛的应用，包括病原体鉴定、食品安全监测、基因组分析、宏基因组环境监测和细菌抗生素耐药性表征。
纳米孔蛋白测序是如何工作的？
正如该术语所暗示的那样，纳米孔测序从根本上讲是通过利用分子适配器共价连接的纳米孔来进行的。在将纳米孔蛋白固定到电阻膜上后，利用运动蛋白引导核酸通过纳米孔。当核酸穿过纳米孔时，电荷发生改变，引发电阻膜上电流的变化。鉴于纳米孔的直径非常小，只允许单个核酸聚合物通过。由于每个核酸碱基——腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）——都具有独特的电荷特性，当它们通过蛋白质纳米孔时，会引起电流的独特中断。通过实时监测和解释这些电流信号，可以确定碱基序列，从而实现测序。有关基本原则的更深入探讨，请参阅文章“纳米孔测序原理".
图1纳米孔测序的工作原理
纳米孔测序的优势
与传统的工作流程相比，纳米孔测序仪具有一些突出的优势。
- 对于高分子量DNA（HMW-DNA）样本，几百kb的超长读取长度可以在一次连续读取中测序。纳米孔测序数据显著改善了从头基因组组装和结构基因组变异和转录组研究。
- 纳米孔是自然界中形成穿过膜的通道的纳米级孔。纳米孔使离子电流通过纳米孔并测量电流的变化。当DNA或RNA等分子穿过纳米孔时，它们会导致电流中断。关于电流变化的信息可用于识别该分子。它直接对感兴趣的天然链进行测序，无需光学或放大。不同类型的文库制备方案允许使用表观遗传信息进行直接DNA/RNA测序。
- 序列数据的实时流可以快速洞察样本、按需测序和动态工作流程。
纳米孔测序的应用
全基因组组装中的纳米孔测序
In historical short-segment genome assembly practices, the complexities of some animal and plant genomes—characterized by polyploidy, high repetition, and high heterozygosity—have proved to be profoundly challenging for successful genomic assembly. Nevertheless, Nanopore sequencing technology, with its inherent long-read characteristic, is advantageous in fostering the assembly of large genomes. This can substantially augment the integrity of the assembled genome.
全长转录组的纳米孔测序
以前的转录组分析不能直接对RNA进行测序，通常需要将mRNA片段化，然后逆转录为cDNA，从而无法捕获和分析全长转录物。Nanopore测序的长读特征可以准确地识别每个基因的多种亚型，在保持精度的同时简化了过程。此外，该技术允许直接进行RNA测序，从而直接鉴定RNA碱基修饰。
纳米孔测序在检测大结构变异中的应用
基因组中存在许多与人类疾病相关的大结构变异（如缺失、倒置和易位等）。短读测序无法准确检测这些变异。然而，纳米孔测序具有较长的读取长度，更适合检测这些大的结构变异，在疾病研究及其他领域展现出广阔的前景。
纳米孔测序用于微生物群的快速鉴定
纳米孔测序技术的快速和实时特性加快了微生物群的鉴定。这项技术创新实现了基于现场的采集点测序，简化了序列信息采集过程。随后，这允许进行分类，并以更高的效率和速度鉴定各种微生物物种。因此，纳米孔测序为快速阐明微生物身份做出了重大贡献。
我们的纳米孔测序服务
博凯森生物 offers nanopore sequencing as a service. The PromethION offers on-demand use of up to 48 Flow Cells – each of which can generate up to 100Gb of sequencing data.
我们的纳米孔测序服务组合包括：
- 纳米孔全长转录序列测定
- 纳米孔直接RNA测序
- 纳米孔宏基因组测序
- 纳米孔 重新 全基因组测序
我们还提供 长读测序服务 通过利用 PacBio SMRT长读测序 技术
图2推进
样品要求
脱氧核糖核酸
建议使用Qiagen DNeasy试剂盒分离DNA，并用RNase处理。
外径260/280为1.8，外径260/230为2.0-2.2。
通过脉冲场或低百分比琼脂糖凝胶分析测量的平均片段大小>30kb。
Input mass, measured by Qubit, >5 µg at a concentration of 100ng/µL.
缓冲液中不含洗涤剂或表面活性剂，建议使用10 mM TRIS（pH=8.0-8.4）。
核糖核酸
RIN，不小于8.0。
Input mass, as measured by Qubit RNA HS assay, >2 µg at a minimum concentration of 50 ng/µL.
260:280的比例约为2.0。260:230的比例为2.0-2.2。
缓冲液中没有洗涤剂或表面活性剂。
全长转录特征 慢性淋巴细胞白血病SF3B1突变揭示保留内含子下调
SF3B1是关键剪接体U2 snRNA的编码基因，该基因的突变与慢性淋巴细胞白血病（CLL）、乳腺癌症和骨髓增生异常综合征等疾病的发展有关，在CLL患者中患病率最高。在这项研究中，选择了三个没有SF3B1突变的CLL患者样本（CLL SF3B1WT）、三个有SF3B1K700E突变的CLL患者样本（CL SF3B1K7000E）和三个正常B淋巴细胞样本作为研究对象。使用Nanopore技术平台进行全转录组测序，并开发FLAIR工作流程来鉴定高置信度转录本。这导致发现了与SF3B1突变相关的剪接位点的变化，与SF3B1突变相关的保留内含子转录物的变化，以及有效和无效同工型的变化。
图2推进
参考：
- Tang，A.D.，Soulette，C.M.，van Baren，M.J.等人。慢性淋巴细胞白血病SF3B1突变的全长转录特征揭示了保留内含子的下调。 国主页通讯社 11, 1438 (2020).
