的本质 DNA 测序 在于识别四种核苷酸：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）。然而，由于两个主要原因，识别过程具有挑战性。首先，这些碱基非常微小，存在于纳米尺度。其次，嘌呤碱基对和嘧啶碱基对的化学结构非常相似，使它们的分化变得复杂。自从1953年提出DNA双螺旋结构以来，生物学主页一直在不懈地寻找各种方法来鉴定这四种碱基。
目前主要的测序方法包括将四种碱基的存在转化为信号，如光、溶液pH值的变化或电信号。根据放大信号的差异，可以辨别出不同的碱基。这些策略构成了当前主流测序设备的支柱。值得注意的是，Sanger、Illumina、BGIseq和Pacbio等平台都选择了光信号。相反，Ion Torrent利用溶液pH值的变化，Nanopore有利于电信号。测序过程不仅依赖于尖端技术，还强调了类似于艺术形式的创新方面。
范式 纳米孔测序 技术的萌芽阶段可以追溯到20世纪90年代，其演变取决于三次关键的技术飞跃。最初，实现了单个DNA分子通过纳米孔的传输；这是一项壮举，随后在纳米孔上采用酶法以单核苷酸分辨率进行测序监督。最终，单核苷酸测序精度成为现实。这些创新的进步共同推动了 纳米孔测序 技术。
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纳米孔测序 operates on the principle of immersing an artificially synthesized polymer membrane in an ionic solution. This polymer membrane is punctuated with modified transmembrane channel protein structures, also known as nanopore protein or "Reader" proteins. These proteins are integral to nanopore sequencing operation. Given the biological activity of the Reader protein, the chip should be stored in a refrigerator at a temperature ranging from 4-8°C and positioned away from the refrigerator walls to prevent freezing due to lower local temperatures.
ONT直接DNA测序尚倩（Xie等，2021）
蛋白质包埋的人工膜结构具有不溶性。因此，当施加外部电场时，电流仅通过纳米孔传输。施加在膜两侧的不同电压会产生电压差，导致DNA在运动蛋白的影响下通过纳米孔展开和易位。此时，单个核苷酸将引起特定的离子电流变化。这种膜具有高电阻特性。通过向浸入电化学溶液的膜施加电势，可以在纳米孔位点产生离子电流。
电流通过纳米孔。（来源：牛津纳米孔技术公司）
ONT直接DNA测序（谢尚倩等，2021）
由于核酸分子在未经处理的状态下经历定向控制的电流流动时显示出高度的随机性，这不利于测序。因此，与其他高通量测序方法一样，纳米孔测序也需要构建文库。
库适配器的两条链分别连接到运动蛋白和Y适配器。Y型适配器与膜上的连接器臂相互作用，有助于在纳米孔上定位库。适配器上的运动蛋白与纳米孔蛋白直接相互作用，有助于测序过程中的文库定位。它促进核酸的解卷，并调节通过孔的易位速率。
显然，纳米孔收集的初始信号是电信号。由于信号与通道孔中的分子大小有关，因此关于核酸的各种修饰信息保留在电信号中。最终，测序仪以“fast5”文件的形式存储电信号。经过碱基识别过程后，'fast5'文件转换为'fastq'文件，其中包含ATCG碱基序列。
纳米孔碱基以每个电信号五个碱基为单位读取，这与边合成边测序的方法不同。因此，严格来说，用于第二代测序质量评估的Q值不适用于纳米孔测序。Q值定义是每个测量的基准发生误差的概率。因此，使用单个碱基质量值评估纳米孔测序是不合适的。纳米孔测序采用了一套独特的质量控制标准，称为共识准确性。
值得注意的是，纳米孔的精度正在不断提高。截至2023年，新开发的Q20试剂可确保中位测序准确率超过99%。同样，高通量测序也不是绝对的标准。它最终通过评估特定基因座的测序深度来确定该基因座的碱基。
为了更深入地了解 纳米孔测序，考虑参考以下条款：“为什么选择纳米孔测序", "用于结构变异检测、HLA分型和STR分析的纳米孔测序", "纳米孔测序技术的应用", "纳米孔测序：原理、平台和优势“，以及”全长转录测序：PacBio Iso-Seq和纳米孔直接RNA-Seq的比较".
